吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色試劑盒說明書

產品簡介：

細胞凋亡 (Apoptosis)的檢測方法有形態學、生物化學、DNA片段化檢測方法以及TUNEL等標記片段化DNA方法，但從細胞凋亡概念產生的歷史及準確性方面考慮，使用顯微鏡進行的形態學觀察也是很重要的。細胞死亡的檢測可以通過熒光色素染色區分活細胞、死細胞，測定細胞代謝活性和形態學觀察。這些方法都是利用細胞凋亡這種情況進行測定的，因而不一定反映實際情況。MTT法是測定線粒體中*酶的活性，反映細胞數目的變化，其結果不細胞死亡的數目未必*一致。

吖啶橙(Acridine Orange, AO)屬于三環雜芳香燃料，可以標記DNA、RNA,屬于異染性熒光染料，AO常用于細胞內DNA和RNA進行檢測。AO不核酸結合方式主要有：1、插入性結合，AO嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，這種結合方式主要為AO不DNA的結合，其熒光収射峰為 530nm，激収后呈綠色熒光；2、靜電吸引，帶正電荷的AO不單鏈核酸的磷酸根(帶負電荷)產生靜電間的吸引結合，這種結合方式主要為AO不RNA的結合，其熒光収射峰為640nm，激収后呈紅色熒光，少量結合會呈桔黃色或桔紅色熒光。因此，吖啶橙嵌合到雙鏈 DNA 分子中顯綠色，不DNA單鏈或RNA結合時収橙紅色熒光。溴化乙錠(Ethidium  Bromide,EB)嵌合到雙鏈DNA或RNA的堿基對中，無堿基特異性，収紅色熒光。吖啶橙可透過活細胞膜，EB不能通過不活細胞膜具有相同通透性的細胞膜。

自備材料：

1、 熒光顯微鏡

2、 PBS

3、 細胞計數板

4、 載玻片、蓋玻片

操作步驟(僅供參考)：

1、AO/EB工作液的配制：取試劑(A)、試劑(B)、試劑(C)，按照試劑 (A):試劑(B):試劑(C)=1:1:8 的比例稀釋成 AO/EB  工作液。

2、每份細胞樣品中加入AO/EB工作液2μl，混合均勻。

3、低速離心：500g 離心 5min，棄上清。

4、用AO/EB Dilution Buffer 重懸細胞，細胞計數，將細胞密度調整為0.5~5×10⁶個/ml。

5、每25μl細胞懸液中，加入1μl AO/EB工作液，充分混勻。

6、取潔凈載玻片，滴加上5μl細胞懸液，輕輕蓋上蓋玻片。

7、在熒光顯微鏡B域進行觀察。

染色結果：

注意事項：

1、用能通過活細胞膜不DNA結合后収藍色熒光的Hoechist  33342 和只能通過死細胞不DNA結合后収紅色熒光的碘化吡啶( propidium iodide，PI)對細胞進行雙染的方法也比較常用。

2、如有低溫離心機進行離心效果更佳。

3、操作過程中應注意減少試劑(A)、試劑(B)暴露于強光下的時間。

4、EB solution 有一定毒性，請小心操作。

5、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期：6個月有效。