通用基因組 DNA 提取試劑盒使用說明書

通用基因組 DNA 提取試劑盒使用說明書

規格：50T/ 100T

保存：室溫(15℃-25℃) 干燥保存，復檢期 12 個月，2℃-8℃保存時間更長。開封后請將 RNase A，蛋白酶 K于-20℃保存。

        試劑盒內容：     50T         100T

         RNase A             1ml             1ml×2

                蛋白酶 K             1ml            1ml×2

                溶液 A                25ml            50ml

                溶液 B                25ml            50ml

          漂洗液          15ml      15ml×2

          洗脫液                 15ml              30ml

          吸附柱           50個       100個

          收集管           50個       100個

           說明書           1份        1份

產品簡介：

    本試劑盒為通用型，適合于從土壤，糞便，昆蟲，以及其他樣本中提取基因組 DNA。對細菌，真菌，昆蟲等樣本都具有很好的裂解效果，大限度的保留了生物 DNA 的多態性。

     使用本試劑盒提取的 DNA 產量大、完整性好，可直接用于各種常規操作，包括酶切、PCR 、文庫構建、Southern 雜交等實驗。

操作步驟：

     使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標簽。所有離心步驟均為使用臺式離心機

在室溫下離心。

1、樣品的處理：

1）土壤：稱取 0.1-0.3g (根據干濕)土壤，放入研缽中，倒入適量的液氮，立即研磨，重復 3 次，使土壤顆粒研成粉末，加 500ul 溶液 A，振蕩至*懸浮。

2）糞便：稱取 0.1-0.3g (根據干濕) 糞便，加 500ul 溶液 A，振蕩至*懸浮。

3）昆蟲：稱取 0.1-0.3g 昆蟲，倒入適量的液氮，立即研磨，重復 3 次，使昆蟲研成粉末，加 500ul 溶液A，振蕩至*懸浮。

4）未知樣品，如為細未狀，可直接稱取 0.1-0.3g(根據干濕)加 500ul 溶液 A，如為塊狀，可 0.1-0.3g 用液氮研磨成粉未，再加 500ul 溶液 A，振蕩至*懸浮。

2、向懸浮液中加入 20ul 的 RNase A（10mg/ml），55℃放置 10min。

3、加入 20ul 的蛋白酶 K（10mg/ml），充分混勻，55℃水浴消化，30min。消化期間可顛倒離心管混勻數次，12000 轉離心 10min。將上清轉移到一個新的離心管中。如有沉淀，可再次離心。

4、加入 500ul 溶液 B，充分混勻。如出現白色沉淀，于 55℃放置 5min，沉淀即會消失，不影響后續實驗。如溶液未變清亮，說明樣品消化不*，可能導致提取的 DNA 量少及不純，還有可能導致上柱后堵柱子，請增加消化時間。

5、加入 500ul 無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀，不影響 DNA 的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，放置 2min (分兩次加入，每次 700ul)。

6、12000rpm 離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

7、向吸附柱中加入 600ul 漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

8、向吸附柱中加入 600ul 漂洗液，12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中

9、12000rpm 離心 2min，將吸附柱置于室溫或 50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續的實驗如酶切、PCR 等。

10、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 50-200ul 經 65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置 5min，12000rpm 離心 2min。

11、離心所得洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置 2min，12000rpm 離心 2min，即可得到高質量的基因組 DNA。

注意事項：

1、由于樣品不同，終提取的 DNA 含量和純度也有所不同，一般來說，如果所提取 DNA 用電泳的方法檢測不到，PCR 會有結果，樣品盡可能的新鮮。否則會導致提取的 DNA 片段較小且提取量也下降。

2、若試劑盒中的溶液出現沉淀，可在 65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響提取效果。

3、如果樣品消化不*，后面的離心步驟中可能會出現堵柱子的情況，可適當延長離心時間。

4、洗脫緩沖液的體積不少于 50ul，體積過小會影響回收效率；洗脫液的 pH 值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調至此范圍)，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率；DNA 產物應保存在-20℃，以防 DNA 降解。

5、DNA 濃度及純度檢測（濃度較高時）：得到的基因組 DNA 片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。回收得到的 DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA 應在 OD260 處有顯著吸收峰， OD260 值為 1 相當于大約 50μg/ml 雙鏈 DNA、40μg/ml 單鏈 DNA。OD260/OD280 比值應為 1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為 pH 值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。