His標簽蛋白純化預裝柱

中文名稱：His標簽蛋白純化預裝柱

英文名稱：Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5ML

產品規格：5ml|1ml

Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交聯的6%瓊脂糖凝膠為基質，通過化學方法偶聯四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni2+）后，形成非常穩定的八面體結構，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結構可保護鎳離子免受小分子的進攻，更加穩定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件。此外，因其基質的耐壓性（該基質可以耐受高0.3 MPa的壓力），該產品可以用于工業大規模蛋白的純化，可在相對較高的流速下，實現對目的蛋白的純化。

Ni-NTA 6FF Chromatography Column是一種以Ni-NTA Agarose Resin 6FF為填料的中壓預裝柱，該預裝柱具有標準接口，可以適配商品化的各類中壓色譜系統，如ÄKTA等，方便客戶用于純化His-tag蛋白。

基質（Matrix）：高度交聯的6%瓊脂糖凝膠
孔徑（Bead size）：45-165µm
載量（Capacity）：＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基質
耐壓（Tolerance Pressuremax）：0.3MPa, 3bar
儲存緩沖液：含20%乙醇的1×PBS
柱子尺寸（Column Size）：0.7×2.5cm（1ml）
儲存條件：4℃保存，有效期2年

注意事項
1）建議純化所用緩沖液和蛋白溶液經0.22µm或0.45µm濾膜過濾后上柱使用。
2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法
（一）純化流程

1 緩沖液的準備
緩沖液使用原理：低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。Buffer 在使用前用0.22µm或0.45µm濾膜過濾除菌?？扇苄越M氨酸標簽蛋白純化所需配方詳見附表1。包涵體組氨酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方詳見附表2。

2 樣品準備
2.1 細菌表達的蛋白（本說明以細菌表達蛋白為例）
1）挑取單菌落到含有適合抗性的LB培養基中，根據載體說明加入相應的誘導劑誘導相應的時間。
2）表達結束后，將培養液轉至離心瓶，7000rpm，離心15min，收集菌體，然后加入1/10體積的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其終濃度為1mM），同時也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹脂的結合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作濃度為1mg/ml?！咀ⅰ浚喝绻磉_的宿主細胞內含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）將菌體沉淀懸浮起來（如果菌液濃度高，可考慮加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I），混勻，置于冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液，10000rpm，4℃離心20-30min。取上清，0.22µm/0.45µm濾膜過濾后，置于冰上備用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達的可溶性蛋白
將細胞培養液轉移至離心瓶，5000rpm離心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、組氨酸和還原劑等，即可直接上柱純化；如含有EDTA、組氨酸和還原劑等物質，則需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】：對于大量體積的上清，需加入硫酸銨進行沉淀濃縮，之后經1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵體蛋白純化（以細菌為例）
1）將培養液轉移至離心瓶，7000rpm，離心15min，收集菌體去上清。
2）按照菌體：裂解液=1:10（w/v）的比例將菌體充分懸浮，混勻，冰浴超聲破碎。
3）將破碎液轉移至離心管，10000rpm，4℃離心20-30min，去上清。可重復步驟2）和3）一次。
4）按照菌體：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例將包涵體充分懸浮。
5）變性條件下純化His標簽蛋白純化。

3 樣品純化（以AKTA使用為例）
1）將泵管道注滿去離子水。去掉產品上塞，連接至色譜系統中，再折斷下口，將預裝柱連接到色譜系統中，注意旋緊。
2）3-5倍柱體積去離子水沖洗出存儲緩沖液。
3）至少5倍柱體積的Lysis Buffer 平衡色譜柱。推薦流速為5ml/min。
4）利用泵或注射器上樣。【注】：若樣品粘度增加，即使上樣體積很少也會導致層析柱很大的反壓；上樣量不要超過柱子的結合能力；大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進樣器更難使用。
5）Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收達到一個穩定的基線（一般至少10-15個柱體積）。【注】：在樣品和結合緩沖液中加入低濃度咪唑可以提高樣品純度。
6）Elution Buffer一步法或梯度法進行洗脫。一步法洗脫中一般5倍柱體積洗脫液即可。梯度洗脫可以用一個小的梯度，例如20倍柱體積或更多來分離不同結合強度的蛋白質。
7）建議用更高濃度咪唑（如500mM）*清洗純化柱上結合的雜蛋白。隨后依次用3倍柱體積的Lysis Buffer和5倍柱體積的去離子水清洗樹脂。5倍柱體積的20%乙醇平衡樹脂，后將樹脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

4 SDS-PAGE檢測
將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進行檢測，判定其純化效果。

（二）在位清洗
當填料使用過程中發現反壓過高（＞0.5Mpa）或者填料上面出現明顯的污染時，需對其進行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗時，先把Ni2+脫掉，清洗結束后，將填料保存在20%乙醇中，后者重新掛Ni后再保存在20%乙醇中。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
1 去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類
使用30%異丙醇清洗5-10個柱體積，接觸時間為15-20min可以去除此類污染物。之后再用去離子水清洗10倍柱體積。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或者堿性溶液清洗填料2倍柱體積。例如含有0.1-0.5%非離子去污劑的0.1M醋酸溶液，接觸時間為1-2h。去污劑處理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱體積，*去除去污劑。后利用去離子水清洗10倍柱體積。
2 去除離子作用結合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接觸10-15min，之后用去離子水清洗10倍柱體積。

（三）填料再生
當填料使用過程中發現反壓過高（＞0.5Mpa），填料上面出現明顯的污染，或填料載量明顯變低時，需要對其進行鎳離子剝離及重新掛鎳處理，即填料再生。按照下面操作流程進行：
1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱體積；
2）去離子水清洗5倍柱體積；
3）2%SDS清洗3倍柱體積；
4）去離子水清洗5倍柱體積；
5）乙醇清洗5倍柱體積；
6）去離子水清洗5倍柱體積；
7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱體積；
8）去離子水清洗5倍柱體積；
9）100mM NiSO4清洗5倍柱體積；
10）去離子水清洗10倍柱體積。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃備用。