脂肪酸β氧化速率比色法檢測試劑盒產品說明書

主要用途

      脂肪酸β氧化速率（β oxidation rate）比色法檢測試劑是一種旨在通過棕櫚酰肉堿氧化依賴性鐵還原，即單位時間還原產物的峰值降低，即采用比色法來測定線粒體裂解樣品中脂肪酸β氧化速率經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞、組織中線粒體裂解懸液樣品（動物、人體等）脂肪酸β氧化速率的檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

      脂肪酸β氧化過程（β-oxidation）在動物組織的線粒體發生的脂肪酸代謝通路，可概括為活化、轉移、β氧化及后經三羧酸循環被*氧化生成CO2和H2O，并釋放能量等四個階段，是體內，尤其是組織器官，例如肝臟、心臟和骨骼肌等能量內平衡的關鍵代謝通路。食物中甘油三酯提供體內三分之一的能量供給，骨骼肌和心臟消耗80%的總能量。脂肪酸代謝異常，將導致脂質聚集在非脂肪組織內，產生慢性病的病理基礎，例如糖尿病、心衰、肥胖癥等。其中β氧化，包括脫氫、水合、二次脫氫和硫解，是將活化的各種長度脂酰輔酶酯（acyl CoA esters）不斷縮短為乙酰輔酶A（acetyl CoA）單位，后經過三羧酸循環和呼吸鏈氧化成CO2和水。脂?；o酶A脫氫酶（acyl CoA dehydrogenase；AD；EC.1.3.99.3）是脂肪酸代謝進入β-氧化后工作的重要酶之一。通過底物棕櫚酰肉堿（palmitoyl carnitine）的氧化產生的電子，由鐵（ferricyanide）捕獲而還原，其還原速率的檢測，來評價β氧化的速率，即吸光值（420nm波長）的下降與時間的對應關系。                        

產品內容

緩沖液（Reagent A）  毫升

反應液（Reagent B）  毫升

底物液A（Reagent C）  毫升

底物液B（Reagent D）  毫升

陰性液（Reagent E）    毫升

產品說明書     1份

保存方式

保存反應液（Reagent B）、底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應操作的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

• 測定準備
• 準備好待測樣品（例如純化線粒體），至于冰槽里備用
• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長420nm和470nm，間隔1分鐘，讀數6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度
• 背景對照測定
• 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升反應液（Reagent B）
• 加入xx微升底物液A（Reagent C）
• 加入xx微升底物液B（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照【（OD420—OD470）0分鐘－（OD420—OD470）5分鐘】
• 樣品測定
• 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升反應液（Reagent B）
• 加入xx微升底物液A（Reagent C）
• 加入xx微升底物液B（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（500微克線粒體蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數【（OD420—OD470）0分鐘－（OD420—OD470）5分鐘】 

四、計算氧化速率

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要 
• 加樣后3秒內比色測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續5分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有氧化功能
• 建議待測樣本線粒體蛋白濃度為500微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 本公司提供系列脂肪酸代謝檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感