乙酰輔酶A含量檢測試劑盒說明書

注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。
規格：50T/48S 
產品內容：
試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存。臨用前加入 500µL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復凍融。
試劑三：液體 20µL×1 支，4℃保存。臨用前加入 500µL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加入 45mL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復凍融。
試劑五：液體 60mL×1 瓶，4℃保存。
工作液的配制：臨用前請根據擬用工作液體積（樣本數×0.92 m L），將試劑二、三和四按照1:1:90的比例混合，或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻（可以測定48樣）；加樣前置37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴鍋中預熱30 min；現配現用；
產品說明：
乙酰輔酶 A 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中。是生物體能源物質代謝過程中產生的一種重要的中間代謝產物。在體內能源物質代謝中是一個樞紐性的物質。糖、脂肪、蛋白質三大營養物質通過乙酰輔酶 A 匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環和氧化磷酸化，經過這條通路*氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于 ATP 合成。此外，乙酰輔酶 A 是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質的前體物質。
蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和 NAD 生成草酰乙酸和 NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯反應，乙酰輔酶A 含量和NADH 的生成速率成正比，340nm 下吸光值的上升速率反應了乙酰輔酶 A 含量的高低。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。操作步驟：
一、乙酰輔酶A 的提取
1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

 二、測定步驟
1、分光光度計預熱 30min，用蒸餾水于 340nm 處調零。
2、取 920µL 工作液和 100µL 樣本至 1mL 石英比色皿，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 的吸光值 A1
和 80s 時的吸光值 A2，計算?A=A2-A1。三、乙酰輔酶 A 含量計算
標準條件下測定的回歸方程為 y = 1640x + 0.012；x 為吸光值，y 為標準品濃度（nmol/mL）。注意：本試劑盒比較低檢測限為 1.6nmol/mL。
1.按照蛋白濃度計算
乙酰輔酶 A 含量(nmol prot)=[(1640×?A＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×?A＋0.012) ÷Cpr
需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。
2.按照樣本質量計算
乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×?A＋0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×?A＋0.012) ÷W
(3 ) 按照細菌或細胞密度計算：
乙酰輔酶 A 含量(nmol/104)=[(1640×?A＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×?A＋0.012)÷500
V1：加入反應體系中樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。