組織基質金屬蛋白酶13活性熒光定量檢測試劑盒說明書

主要用途

    組織基質金屬蛋白酶13（MMP13）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針MCA供體和DAP/DNP受體雙重標記的多肽底物PChaGNvaHA，受到MMP13蛋白酶的水解，解離抑制基團，產生熒光產物，即采用熒光法來測定樣品中酶活性而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中基質金屬蛋白酶13的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，安全可靠。

產品內容

清理液（Reagent A）         毫升

裂解液（Reagent B）         毫升

緩沖液（Reagent C）         毫升

底物液（Reagent D）         微升

標準液（Reagent E）              微升

產品說明書             1份

保存方式

保存底物液（Reagent D）和標準液（Reagent E）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標準樣品配制和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養箱：用于反應孵育

黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、樣品準備

1． 手術取出動物組織，并秤重500毫克

2． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （選擇步驟）抽去清理液

5． 移入到一個液氮凍存管

6． 即刻放進液氮罐過夜

7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8． 放進一個15毫升錐形離心管

9． 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 

10． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11． 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）

12． 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g

13． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管

14． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

15． 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如組織裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設定好熒光酶標儀（溫度為37℃）：激發波長330nm，散發波長400nm，間隔5分鐘，讀數6次（共30分鐘）

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 標準樣品配制

1． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管

2． 分別加入xx微升緩沖液（Reagent C）到1至5號管

3． 移取xx微升標準液（Reagent E）到1號管，混勻

4． 小心移取xx微升1號管稀釋的標準液（Reagent E）到2號管，混勻

5． 小心移取xx微升2號管稀釋的標準液（Reagent E）到3號管，混勻

6． 小心移取xx微升3號管稀釋的標準液（Reagent E）到4號管，混勻

7． 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

四、熒光測定

1． 在黑色96孔板上做好相應標記：標準樣品、樣品活性

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里

3． 分別加入20微升上述配制的標準液或待測樣品（20微克純化酶或100微克組織裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 放進37℃培養箱里孵育10分鐘

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）

6． 輕輕搖動黑色96孔板

7． 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）

8． 標準樣品實際熒光讀數：標準樣品值—背景對照值

9． 待測樣品實際熒光讀數：5分鐘熒光讀數—背景對照熒光讀數

10． 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位RFU；橫座標（X軸）為標準甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

11． 根據標準曲線獲得樣品活性對應甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

五、計算樣品活性

 注意事項

1． 本產品為25次操作，包括標準液

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，標準液測定只需1次

4． 樣品須澄清，至關重要

5． 樣品準備要點如下：

a) 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價陽離子鰲和劑

b) 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）

c) 如果樣品中的基質金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用膠原酶潛酶活化劑（APMA）－GMS12197）

6． 如果用戶沒有特定的濾波器，可以使用激發波長320至340nm之間的任一波長，散發波長390至420nm之間的任一波長

7． 測定值由低到高變化；通常測定持續5分鐘，如果酶活性過低，可以持續測讀30分鐘

8． 熒光讀數增加，表明具有酶活性

9． 待測樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為20微克/20微升；待測樣本為總蛋白，其蛋白濃度為100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）

10． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

11． 可以使用基質金屬蛋白酶13抑制劑CL-82198作為抑制劑對照或陰性對照

12． 基質金屬蛋白酶13活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）水解1納摩爾的多肽底物PChaGNvaHA

13． 本公司提供系列基質金屬蛋白酶檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感

使用承諾

秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承諾"的宗旨為我們的用戶提供優質產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯系，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。