細胞基質金屬蛋白酶總活性熒光定量檢測試劑盒產品說明書

主要用途

細胞基質金屬蛋白酶（MMP）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針MCA供體和DAP/DNP受體雙重標記的多肽底物PLGLAR，在蛋白酶的水解下，解離抑制基團，產生熒光產物，即采用熒光法來測定樣品中酶活性而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中基質金屬蛋白酶（包括1、2、3、7、8、9、10、12、13、14等）的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，安全可靠。

保存方式

保存底物液（Reagent D）和標準液（Reagent E）在-20℃冰箱里；緩沖液（Reagent C）保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標準樣品配制和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養箱：用于反應孵育

黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、樣品準備

 1． 準備好75cm²細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁷細胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、 測定準備 

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設定好熒光酶標儀（溫度為37℃）：激發波長330nm，散發波長400nm，間隔5分鐘，讀數6次（共30分鐘）；增益倍數100至200

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

4． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管

5． 分別加入xx微升緩沖液（Reagent C）到1至5號管

6． 移取xx微升標準液（Reagent E）到1號管，混勻

7． 小心移取xx微升1號管稀釋的標準液（Reagent E）到2號管，混勻

8． 小心移取xx微升2號管稀釋的標準液（Reagent E）到3號管，混勻

9． 小心移取xx微升3號管稀釋的標準液（Reagent E）到4號管，混勻

10． 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

三、熒光測定 

1． 在黑色96孔板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里

3． 分別加入20微升上述配制的標準液或待測樣品（20微克純化酶或100微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 放進37℃培養箱里孵育10分鐘

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）

6． 輕輕搖動黑色96孔板

7． 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）

8． 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位RFU；橫座標（X軸）為標準甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

9． 標準樣品實際熒光讀數：標準樣品值—背景對照值

10． 待測樣品實際熒光讀數：5分鐘熒光讀數—背景對照熒光讀數

11． 根據標準曲線獲得樣品對應甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

12． 活性計算：

根據標準曲線獲得樣品對應甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）X樣品稀釋倍數]÷ 5（反應時間；分鐘）＝納摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克/分鐘