技術文章
Technical articles
更新時間：2021-11-19
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主要用途
組織SRC激酶活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到SRC磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光譜法測定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中SRC活性的經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中SRC激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。
實驗步驟
一、 待測樣品準備
1． 手術取出動物組織，并秤重500毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入XX毫升清理液（Reagent A）清洗
4． （選擇步驟）抽去清理液
5． 移入到一個液氮凍存管
6． 即刻放進液氮罐過夜
7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
8． 放進一個15毫升錐形離心管
9． 加入置于冰槽里的XX微升裂解液（Reagent B）
10． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11． 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）
12． 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
13． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
14． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
15． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、 測定準備
1． 準備好待測樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里
2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數6次（共5分鐘），并置零
3． 緩沖液（Reagent C）置于室溫下均衡溫度
三、 背景對照測定
1． 移取XX微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入XX微升酶促液（Reagent D）
3． 加入XX微升反應液（Reagent E）
4． 加入XX微升底物液（Reagent F）
5． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
6． 加入XX微升陰性液（Reagent G）
7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘
四、 樣品測定
1． 移取XX微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入XX微升酶促液（Reagent D）
3． 加入XX微升反應液（Reagent E）
4． 加入XX微升底物液（Reagent F）
5． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
6． 加入5微升待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白；樣品須溶解）
7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘
五、 計算樣品活性 單位＝微摩爾NADH/分鐘
六、 酶標板測定
1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
2． 分別移取XX微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中
3． 分別加入XX微升酶促液（Reagent D）
4． 分別加入XX微升反應液（Reagent E）
5． 分別加入XX微升底物液（Reagent F）
6． 輕輕搖動96孔酶標板
7． 在30℃溫度下孵育3分鐘
8． 分別加入XX微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克組織裂解懸液蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
9． 輕輕搖動酶標板
10． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
11． 活性計算：
注意事項
1． 本產品為25次操作，包括背景操作
2． 操作時，須戴手套
3． 系統操作過程中，背景測定只需1次
4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
5． 樣品須澄清，至關重要
6． 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光譜測定
7． 測定值由高到低變化；測定可持續30分鐘
8． 光譜測定后，比色皿須清洗*
9． 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有酶活性
10． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
12． 可以使用SRC抑制劑（4-(4′-Phenoxyanilino)-6,7-dimethoxyquinazoline；IC50=44納摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
13． Src激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
14． 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品
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