技術文章
Technical articles
更新時間：2021-12-17
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主要用途
細菌甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase）活性酶連續循環光度法定量檢測試劑是一種旨在通過底物甲羥戊酸受到甲羥戊酸激酶磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光度法測定其氧化后峰值（NADH濃度）的變化，以分析樣品中甲羥戊酸激酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細菌，尤其是革蘭氏陽性菌樣品的甲羥戊酸激酶活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品預處理
分光光度儀或酶標儀：用于樣品光度分析
實驗步驟
一、 待測樣品準備
1． 準備好10毫升待測的細菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107細胞/毫升
3． 置于冰槽里5分鐘
4． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
5． 小心抽去上清液
6． 加入200至500微升GENMED裂解液（Reagent A），充分混勻
7． 轉移到預冷的1.5毫升離心管
8． 加入12.5微升GENMED活性液（Reagent B）
9． 強力渦旋震蕩15秒
10． 置于冰槽里15分鐘，期間每隔5分鐘強力渦旋震蕩15秒
11． 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
12． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
13． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用GENMED BCA蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30031.1）
14． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、 測定準備
1． 準備好待測樣品（例如細菌裂解懸液等），置于冰槽里
2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔2分鐘，讀數6次（共10分鐘），并置零
3． GENMED緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫
三、 背景對照測定
1． 移取130微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升GENMED酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升GENMED反應液（Reagent E）
4． 加入20微升GENMED底物液（Reagent F）
5． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
6． 加入10微升GENMED陰性液（Reagent G）
7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘
四、 樣品測定
1． 移取130微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升GENMED酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升GENMED反應液（Reagent E）
4． 加入20微升GENMED底物液（Reagent F）
5． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
6． 加入10微升待測樣品（注意：50微克細菌裂解蛋白；樣品須溶解）
7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘
五、 計算樣品活性
[（樣品讀數－背景讀數）X 0.2（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X光徑距離（光徑距離；厘米）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升
轉換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾NADH/分鐘
六、 酶標儀測定
1． 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
2． 分別移取130微升GENMED緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3． 分別加入20微升GENMED酶促液（Reagent D）
4． 分別加入20微升GENMED反應液（Reagent E）
5． 分別加入20微升GENMED底物液（Reagent F）
6． 輕輕搖動96孔板
7． 在30℃溫度下孵育3分鐘
8． 分別加入10微升GENMED陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細菌裂解懸液蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
9． 輕輕搖動96孔板
10． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和10分鐘讀數
11． 活性計算：
[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.2（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 0.5（光徑距離；厘米）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升
轉換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾NADH/分鐘
當前位置：
