細胞蛋白磷酸化酶2A 活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞蛋白磷酸化酶2A（PP2A）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用特異性合成底物磷酸化多肽，在PP2A去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產生鉬藍顯色反應后峰值的變化，采用比色法測定其峰值的變化，以此進行測算單位酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細胞裂解懸液樣品包括免疫沉淀復合物和粗提或部分純化酶樣品的蛋白磷酸化酶2A活性及其抑制劑的檢測。廣泛應用于細胞凋亡、蛋白組學、病理生理學、變等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應液（Reagent E）、顯色液（Reagent F）和專性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸； 有效保證6月

 用戶自備

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品收集

培養箱：用于孵育反應物

500微升1厘米光徑比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、 樣品準備

1． 準備好75cm²細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（5 X 10⁷細胞）

2． 小心加入3毫升預冷的清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞 

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取2微升進行蛋白定量測定（注意：建議使用 Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）

2． 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為660nm，并置零  

3． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管

4． 按下表分別加入陰性液（Reagent D）和標準液（Reagent G）到每個離心管，混勻

5． 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

三、 標準曲線測定

1． 移取200微升上述配制的標準液到新的比色皿

2． 在30℃溫度下孵育20分鐘

3． 加入200微升顯色液（Reagent F），混勻

4． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

5． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

6． 重復實驗步驟1至6四次

7． 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準磷濃度（微摩爾/升）

四、 （選擇步驟）樣品背景測定

1． 移取120微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白） 

3． 在30℃溫度下孵育20分鐘

4． 加入60微升陰性液（Reagent D），混勻

5． 加入200微升顯色液（Reagent F），混勻

6． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

7． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

8． 根據標準曲線獲得樣品背景對應磷濃度（微摩爾/升

五、 樣品總活性測定

1． 移取100微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白） 

3． 在30℃溫度下孵育2分鐘

4． 加入20微升反應液（Reagent E）

5． 在30℃溫度下孵育20分鐘

6． 加入60微升陰性液（Reagent D），混勻

7． 加入200微升顯色液（Reagent F），混勻

8． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

9． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

10． 根據標準曲線獲得樣品總活性對應磷濃度（微摩爾/升）

六、 樣品非特異性活性測定

1． 移取90微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入10微升專性液（Reagent H）

3． 加入20微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白） 

4． 在30℃溫度下孵育5分鐘

5． 加入20微升反應液（Reagent E）

6． 在30℃溫度下孵育20分鐘

7． 加入60微升陰性液（Reagent D），混勻

8． 加入200微升顯色液（Reagent F），混勻

9． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

10． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

11． 根據標準曲線獲得樣品非特異活性對應磷濃度（微摩爾/升）