細胞逆轉錄酶活性熒光定量檢測試劑盒 產品說明書

主要用途

細胞逆轉錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過雙鏈分子底物，在dTTP的參與下，通過逆轉錄酶的催化，聚合產生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子，由PicoGreen特異染色，即采用熒光法來測定細胞裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）逆轉錄酶的活性，以及抑制劑檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月 

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、 樣品準備

1． 準備好75cm²細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁷細胞）

2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用消化）

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B） 

10． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11． 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器

12． 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約80下）

13． 將所有細胞勻漿物移入1.5毫升離心管

14． 即刻放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g

15． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管

16． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

17． 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設定好熒光酶標儀（溫度為25℃）：激發波長490nm，散發波長520nm；增益倍數50至100 

3． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管

4． 分別加入10微升裂解液（Reagent B）到1至5號管

5． 移取10微升標準液（Reagent H）到1號管，混勻

6． 小心移取10微升1號管稀釋的標準液（Reagent H）到2號管，混勻

7． 小心移取10微升2號管稀釋的標準液（Reagent H）到3號管，混勻

8． 小心移取10微升3號管稀釋的標準液（Reagent H）到4號管，混勻

9． 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

注意事項

1． 本產品為20次操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，標準曲線測定只需1次

4． 樣品須澄清，至關重要

5． 每個樣品需要進行平行測試：失活樣品和待測樣品，以排除樣品DNA本底

6． 失活樣品：將待測樣品置于70至90度水浴鍋孵育10分鐘，然后置于冰槽里冷卻

7． 樣品中避免使用EDTA、EGTA、NaCl、MgCl2、Triton X-100等

8． 反應完成后即刻進行熒光測定

9． 測定值由低到高變化

10． 樣本測定樣品讀數高于背景讀數表明具有酶活性

11． 待測樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為10微克/5微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）

12． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

13． 逆轉錄酶單位活性定義為：在25℃，pH 8.1條件下，每小時內能夠轉錄1納克DNA所需的酶量作為一個活性單位