植物腺苷酸激酶活性酶連續循環反應光度法定量檢測 試劑盒產品說明書

主要用途

植物腺苷酸激酶（Adenylate kinase）活性酶連續循環反應光度法定量檢測試劑是一種旨在通過腺苷酸激酶、己糖激酶和葡萄糖6-磷酸脫氫酶的酶連續循環反應系統下，伴隨的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）還原反應后峰值的變化，即采用光度法來測定植物組織裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等腺苷酸激酶的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。 

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、 樣品準備

1． 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定500毫克組織重量 

2． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進一個預冷的15毫升錐形離心管

6． 加入預冷的xx毫升裂解液（Reagent B）

7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

8． 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）

9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為300g 

10． 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管

11． （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為300g 

12． 即刻移入到1.5毫升離心管

13． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

14． 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、 測定準備

1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；緩沖液（Reagent C）室溫下預熱均衡；底物液（Reagent E）避免光照

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（5分鐘讀數－0分鐘讀數）

四、 樣品測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入20微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（5分鐘讀數－0分鐘讀數） 

五、計算樣品活性

六、 酶標儀測定

1． 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里

3． 分別加入xx微升反應液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）

7． 輕輕搖動96孔板

8． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數

9． 活性計算

注意事項

1． 本產品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需1次

4． 建議使用比色皿測定

5． 樣品須澄清，至關重要 

6． 加樣后3秒內光度測定

7． 測定值由低到高變化；測定可持續5分鐘

8． 光度測定后，比色皿須清洗*

9． 樣本測定5分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性

10． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

12． 腺苷酸激酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.6條件下，每分鐘內能夠產生1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）所需的酶量作為一個活性單位

13． 本公司提供系列經典細胞激酶檢測試劑產品