逆轉錄酶活性PERT熒光定量PCR 檢測試劑盒產品說明書

主要用途

逆轉錄酶（reverse transcriptase）活性PERT熒光(SYBR GREEN)定量PCR檢測試劑是一種旨在運用SYBR綠色熒光染料作為標記信號，結合產物增強型逆轉錄酶（PERT）的PCR擴增，既方便、快速，又實時檢測和定量分析擴增產物，即逆轉錄酶酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于臨床病毒感染、生物制品，例如疫苗等病毒污染的監測。產品即到即用，性能穩定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量準確，重復性強。

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；染色液（Reagent F）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃微型臺式離心機：用于樣品操作

PCR管：用于樣品擴增操作的容器

熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應

實驗提示

一、 標準樣品制備

1． 準備好7個無菌的1.5毫升離心管，標記為1至7號管

2． 按下表分別加入18微升的稀釋液（Reagent I）到2至7管

3． 移取5微升標準液（Reagent H）到1號管

4． 小心移取2微升1號管的標準液（Reagent H）到2號管，混勻

5． 小心移取2微升2號管稀釋的標準液（Reagent H）到3號管，混勻

6． 小心移取2微升3號管稀釋的標準液（Reagent H）到4號管，混勻

7． 以此類推

8． 將1至7號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

一、 定量檢測

1． 移取2微升引導液（Reagent A）到0.5毫升PCR管

2． 加入2微升底物液（Reagent B）

3． 加入6微升補充液（Reagent C）

4． 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒

5． 在70℃溫度下孵育3分鐘

6． 冰上預冷

7． 加入13微升轉錄液（Reagent D）

8． 加入2微升上述制備的標準液（Reagent H）或待測樣品（注意：選擇4個標準品+空對照）

9． 總量25微升

10． 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒

11． 在42℃溫度下孵育30分鐘

12． 在95℃溫度下孵育5分鐘

13． 置于冰槽里備用

14． 移取15微升反應液（Reagent E）到0.5毫升PCR管

15． 加入2微升上述冰槽里備用的轉錄產物

16． 加入2.5微升染色液（Reagent F）

17． 加入5.5微升補充液（Reagent D）到總量25微升

18． 使用1000微升槍頭加入1滴封隔液（Reagent G）（注意：參見注意事項10）

19． 即刻放進熒光定量PCR儀

20． 熒光定量PCR反應程序為（選擇FAM染料）：

注意事項

1． 本產品為20次PCR反應

2． 本產品檢測敏感度達10^-8單位/微升

3． 操作時，須戴手套

4． 本產品適合各種熒光定量PCR儀

5． 建議整個操作在4℃下進行

6． 必須使用帶濾芯的槍頭

7． 所有器皿、離心管、液體等無RNA酶污染

8． 使用時，避免污染母液

9． 用戶根據實際情況，選擇4至5管標準區間范圍

10． 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入封隔液（Reagent G）

11． 配制完成后，即刻進行擴增反應，以確保反應物的活性

12． 試劑避免反復凍融

13． PCR擴增反應的最初3個循環為定量基線；3至15個循環的熒光信號的10倍值為熒光閾值；熒光信號達到閾值所需的循環數為Ct值；建議使用Log ΔRn相對定量參數（參考圖像如下）：

1． 通常10³至10⁴皮單位（pU）逆轉錄酶等于1至10個病毒粒子（virion）

2． 通常10³皮單位（pU）逆轉錄酶等于70至80逆轉錄酶分子

3． 本公司提供系列逆轉錄酶活性檢測試劑產品