細菌氫ATP酶活性酶連續反應光譜法定量檢測試劑盒 產品說明書

主要用途

 細菌氫ATP酶（H^＋-ATPase）活性酶連續反應光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用氫ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，在排除其它ATP酶干擾的情況下，受到氫ATP酶的水解產生的ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光譜法測定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算單位酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細菌細胞H^＋-ATP酶的特異性活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

產品內容

裂解液（Reagent A）           毫升

保存液（Reagent B）          毫升

緩沖液（Reagent C）         毫升

酶促液（Reagent D）             微升

反應液（Reagent E）             毫升

底物液（Reagent F）           毫升

陰性液（Reagent G）            毫升

產品說明書                1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

恒溫搖床：用于細菌培養

培養箱：用于反應孵育

比色皿：用于光譜分析的容器

分光光度儀：用于光譜分析

實驗步驟 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光。然后進行下列操作。

一、 樣品準備

1． 準備好10毫升待測的細菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM

2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升

3． 置于冰槽里5分鐘

4． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻

7． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

8． 強力渦旋震蕩15秒

9． 置于冰槽里30分鐘，期間強力渦旋震蕩15秒三次

10． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415）

11． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

12． 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心去掉上清液 

14． 加入xx微升保存液（Reagent B），混勻

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作 

二、測定準備

1． 準備好待測樣品（例如純化細菌細胞膜蛋白等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數7次（共30分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對照測定

1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升酶促液（Reagent D）

3．加入xx微升反應液（Reagent E）

4．加入xx微升底物液（Reagent F）

5．放進37℃培養箱里靜置3分鐘

6．加入xx微升陰性液（Reagent G）

7．上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8．即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數30分鐘

四、樣品活性測定

1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升酶促液（Reagent D）

3．加入xx微升反應液（Reagent E）

4．加入xx微升底物液（Reagent F）

5．放進37℃培養箱里靜置3分鐘

6．加入50微升待測樣品（注意：50微克膜蛋白；樣品須溶解）

7．上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數30分鐘

五、計算樣品活性

注意事項

1．本產品為21次操作，包括背景對照測定

2．操作時，須戴手套

3．系統操作過程中，背景測定只需1次

4．建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  

5．加入樣品啟動反應后3秒內即刻光譜測定

6．反應測定值由高到低變化；測定可以持續30分鐘

7．測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數高于10分鐘或30分鐘測定讀數，表明有酶活性

8．光譜測定后，比色皿須清洗充分

9．建議待測樣本膜蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）

10．樣品特異活性是指排除其它，包括鈣（EGTA處理）、鈉鉀（烏本苷；ouabain處理）等ATP酶的干擾后的氫ATP酶活性

11．氫ATP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

12．本公司提供系列ATP酶類分析技術產品 

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測準確