技術文章
Technical articles
更新時間：2024-12-03
點擊次數：482
主要用途
細胞胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS）活性酶連續循環光度法定量檢測試劑是一種旨在使用胱硫醚-β-合成酶、賴氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶連續循環法反應系統中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光度法測定其氧化后峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算單位酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種動物和人體細胞裂解懸液等胱硫醚-β-合成酶的活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
細胞刮脫棒：用于細胞脫離
（微型）臺式離心機：用于樣品制備
培養箱：用于反應孵育
200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析的容器
分光光度儀或酶標儀：用于光度分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光；緩沖液（Reagent C）室溫下預熱。然后進行下列操作。
一、 樣品準備
1． 準備好75cm2細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 107細胞）
2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入100至500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管
11． 強力渦旋震蕩15秒
12． 置于冰槽里孵育30分鐘
13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、測定準備
1． 準備好上述待測樣品，置于冰槽里
2． 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔2分鐘，讀數6次（共10分鐘），并置零
3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、 背景對照測定
1． 移取140微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入10微升酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升反應液（Reagent E）
4． 加入20微升底物液（Reagent F）
5． 放進37℃培養箱里靜置3分鐘
6． 加入10微升陰性液（Reagent G）
7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘
四、 樣品活性測定
1． 移取150微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入10微升酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升反應液（Reagent E）
4． 加入20微升底物液（Reagent F）
5． 放進37℃培養箱里靜置3分鐘
6． 加入10微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）
7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘
五、 計算樣品活性
[（樣品讀數－背景讀數）X 0.2 （體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升
當前位置：
