技術文章
Technical articles
更新時間：2025-06-13
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主要用途
細胞基質金屬蛋白酶2（MMP2）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針MCA供體和DAP/DNP受體雙重標記的多肽底物PLGLAR，在特定抑制劑存在與否的情況下，受到MMP2蛋白酶的水解，解離抑制基團，產生熒光產物，即采用熒光法來測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或純化酶樣品中基質金屬蛋白酶2的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，安全可靠。
保存方式
保存底物液（Reagent D）、標準液（Reagent E）和專性液（Reagent F）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證3月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于標準樣品配制和樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
培養箱：用于反應孵育
黑色酶標板：用于熒光分析的容器
熒光酶標儀：用于熒光分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。
一、樣品準備
1. 準備好25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 106細胞）
2. 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
5. 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
6. 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7. 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻
10. 轉移到預冷的1.5毫升離心管
11. 強力渦旋震蕩15秒
12. 置于冰槽里孵育30分鐘
13. 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14. 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
15. 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
16. 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、熒光測定
（一）樣品總活性測定
1． 在96孔酶標板上做好相應標記：標準樣品、樣品總活性
2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應孔中
3． 分別加入20微升上述配制的標準液或待測樣品（20微克純化酶或100微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
4． 放進37℃培養箱里孵育10分鐘
5． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）
6． 輕輕搖動96孔酶標板
7． 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）
8． 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位RFU；橫座標（X軸）為標準甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）
9． 根據標準曲線獲得樣品總活性對應甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）
（二）樣品非特異活性測定
1． 在96孔酶標板上做好相應標記：樣品非特異活性
2． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應孔中
3． 加入xx微升專性液（Reagent F）到相應孔中
4． 加入20微升待測樣品（20微克純化酶或100微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
5． 放進37℃培養箱里孵育10分鐘
6． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）
7． 輕輕搖動96孔酶標板
8． 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）
9． 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位RFU；橫座標（X軸）為標準甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）
10． 根據標準曲線獲得樣品非特異活性對應甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）
三、計算樣品活性
（一） 樣品活性（總活性或非特異活性）
（二） 樣品特異
注意事項
1． 本產品為25次操作，包括標準液
2． 操作時，須戴手套
3． 系統操作過程中，標準液測定只需1次
4． 樣品須澄清，至關重要
5． 樣品準備要點如下：
a) 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價陽離子鰲和劑
b) 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）
c) 如果樣品中的基質金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用膠原酶潛酶活化劑（APMA）－GMS12197）
6． 如果用戶沒有特定的濾波器，可以使用激發波長320至340nm之間的任一波長，散發波長390至420nm之間的任一波長
7． 待測樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為20微克/50微升；待測樣本為總蛋白，其蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）
8． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
9． 如果檢測部分或純化酶樣品中基質金屬蛋白酶2，則可以省去非特異活性檢測步驟
10． 基質金屬蛋白酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5的情況下，每單位OA-Hy敏感性酶在單位時間內（每分鐘）水解1納摩爾的多肽底物PLGLAR
11． 本公司提供系列基質金屬蛋白酶檢測試劑產品
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