NADPH- 胞色素C 還原酶NCR 試劑盒說明書

NADPH-  胞色素 C 還原酶 NCR  試劑盒說明書

測定意義

胞色素 P450 酶是一組 要存在于肝臟的同工酶，在外源物質代謝中 有重要作用，尤是藥物和毒物的代謝 NCR 作 P450 酶系的重要一員，催化氧化型 P450 還原再生

測定原理

NCR 催化 NADPH 還原氧化型 胞色素 c，還原型 胞色素 c 在 550nm 處有特征吸收峰通過測定 550nm 吸光度的增加速率，來 算 NCR 活性

自備儀器和用品

可見分光光度計、普通離心機，超速離心機、可調式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 100mL 蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前配制，加 2.6 mL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存 臨用前配制，加 550 µL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提取

1、除去細胞核和線粒體等：稱約0.5g組織，加入4℃預冷的1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g4℃離心30min，取上清液，轉移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分振蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、zui終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，蓋緊后充分振蕩溶解，4℃保存待測。

NADPH-細胞色素C還原酶測定操作：

1、分光光度計預熱30min以上。調節波長到550nm，蒸餾水調零。

2、試劑二在37℃水浴中預熱30min以上。

3. 空白管 取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50µL 蒸餾水 900µL 試劑二 50µL 試劑 和 10µL 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測定 2min 內吸光值變化，第 10 s 和第 130 s 吸光值 注意空白管只需做一次 。

4. 測定管 取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50µL 粗酶液 900µL 試劑二 50µL 試劑 和 10µL，試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測定 2min 內吸光值變化，第 10 s 和第 130 s 吸光值。

NCR 活性 算

(1).按照蛋白濃度 算:

活性單位 U  定義 37℃中， 毫克蛋白 分鐘催化產生 1µmol 還原型 胞色素 C

NCR (U/mg prot)= (△A 測定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷  Cpr×V ÷T

= 0.529×(△A 測定管-△A 空白管)÷Cpr

(2)按照 本質 算:

活性單位 U  定義 37℃中， 克 品 分鐘催化產生 1µmol 還原型 胞色素 C

NCR (U/g)= (△A 測定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷  W×V ÷V 總 ÷ T

= 0.265×(△A 測定管-△A 空白管)÷W

ε ：還原型 胞色素 C 摩爾消光系數，19100L/mol/cm=0.0191L/µmol/cm；d：比色皿光 ，

1cm：V反總：反應體系總體，1010uL=0.00101L：Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL，需要另外測定：V樣：加入反應體系中清液體，50uL=0.05mL： V 樣總：加入提取液體，0.5mL：W ：本質，g ：T：反應時間，2min。